Пулирование (объединение) проб биологического материала для ПЦР-исследования — это инструмент, который может значительно повысить эффективность эпизоотологического мониторинга, но при неправильном применении — критически снизить достоверность результатов.
Пулирование проводится путём объединения равных объёмов нескольких индивидуальных проб в один ‘общий образец’ для проведения одного ПЦР-анализа.
Если результат отрицательный — все пробы в пуле считаются отрицательными.
Если результат положительный — проводится дополнительное индивидуальное исследование каждой пробы из пула.
Главная опасность метода связана с разведением ДНК/РНК возбудителя. Если в пуле присутствует только одна слабоположительная проба с низкой вирусной нагрузкой (Ct 32–38), её разведение отрицательными образцами может привести к ложноотрицательному результату для всего пула.
Второй важный фактор — ингибирование ПЦР-реакции. При объединении проб увеличивается концентрация веществ, подавляющих реакцию (гемоглобин, иммуноглобулины, полисахариды, компоненты фекалий и др.), что может привести к отсутствию амплификации даже при наличии возбудителя.
Дополнительный риск — превышение допустимого размера пула. Для ПЦР допустимо объединение до 3 проб, максимально — до 5. Увеличение количества проб в пуле существенно повышает вероятность ложных результатов.
Метод допустим при скрининге клинически здоровой популяции и эпизоотологическом мониторинге при низкой ожидаемой распространённости инфекции.
Наиболее подходящие материалы — сыворотка, плазма, цельная кровь с антикоагулянтом, смывы со слизистых.
Пулирование возможно для возбудителей со стабильно высокой концентрацией ДНК/РНК в биологическом материале.
Объединение проб должно проводиться строго в рамках одной эпидемиологической единицы (стадо, возрастная группа, цех).
Метод не подходит для диагностики клинически больных животных, расследования падежа, мониторинга эффективности лечения и работы в очагах с высокой заболеваемостью.
Не рекомендуется пулирование проб с высоким содержанием ингибиторов — фекалий, тканей, молока.
Недопустимо объединять пробы от животных с разным клиническим статусом.
Пулирование проб для ПЦР-анализа — это эпизоотологический инструмент, а не универсальный метод диагностики.
Он не снижает специфичность ПЦР, но может критически снизить чувствительность, если не соблюдены строгие условия применения.
Решение об объединении проб должно приниматься осознанно, с учётом цели исследования и пониманием риска пропустить инфицированное животное, что может привести к серьёзным эпизоотическим и экономическим последствиям.
Если цель — получить диагностически значимый результат, особенно при клинических случаях и инфекционных вспышках, предпочтение всегда следует отдавать индивидуальному исследованию.
